1926年元旦，國民黨“二大”在廣州召開，毛澤東作為湖南代表出席，并再次當(dāng)選為國民黨中央候補執(zhí)行委員。在會上，毛澤東和其他共產(chǎn)黨人一起，團結(jié)國民黨左派，積極進行反對“西山會議派”的斗爭。1月8日，毛澤東代表國民黨中央宣傳部作《宣傳報告》。他在結(jié)束語部分講道：“兩年來在革命宣傳與反革命宣傳相對抗之中，革命宣傳確是取一種攻勢……反革命宣傳卻始終是一種守勢。為了招架不住，才抬出‘反共產(chǎn)’、‘赤色帝國主義’這兩塊擋箭牌來。這種對抗攻守的現(xiàn)象，乃中國革命勢力日益團結(jié)進取，而反革命勢力日益動搖崩潰的結(jié)果”。在毛澤東等中國共產(chǎn)黨人和國民黨左派的共同努力下，中國國民黨第二次全國代表大會通過了《處分違犯本黨紀(jì)律黨員決議案》、《彈劾西山會議決議案》等，決定永遠開除鄒魯、謝持的黨籍，對居正、石青陽、葉楚傖等十二人提出警告，責(zé)其改正，命令葉楚傖將上?！睹駠請蟆方怀龈慕M，責(zé)令戴季陶限期反省。大會給“西山會議派”以沉重的打擊。

蔣介石是國共合作中后期統(tǒng)一戰(zhàn)線內(nèi)出現(xiàn)的新右派的代表。1926年3月，蔣介石制造了反共的“中山艦事件”。這是蔣介石向共產(chǎn)黨和國民黨左派發(fā)起進攻的信號。事件發(fā)生后，毛澤東極力主張給予以蔣介石為代表的新右派以堅決回?fù)簟Ｃ┒?沈雁冰)回憶說：“中山艦事變的第二天晚上，毛主席同我談起大局形勢，記得主席說了大體是以下的一些話：蔣介石現(xiàn)在掌握的實力唯第一軍，而第一軍的下級軍官和士兵大部分是有覺悟的，就省城而言，蔣的實力是大的，但就全局而言，蔣的實力是小的。他此番制造中山艦事件，向我們突然進攻，一是威脅，二是試探。我方示弱，他就要得寸進尺；我方強硬，他就要知難而退。故我方萬萬不能示弱妥協(xié)，要堅持同他斗爭?！泵珴蓶|還極力主張“把我們當(dāng)時掌握的武裝力量集中在粵、桂邊境某地(我忘其名)，同時說服國民黨左派撤出廣州，爭取第一軍外各軍(他們同蔣本來有矛盾)反蔣，至少使他們中立，名正言順地聲討蔣背叛統(tǒng)一戰(zhàn)線，破壞國共合作，以武力對武力，逼蔣下臺，削弱他的兵權(quán)?！泵珴蓶|還進一步分析了當(dāng)時各派政治力量及第一軍以外各軍的情況，他指出：“假若我方退讓，則他們會由于蔣的利誘和威脅而倒向蔣?！泵珴蓶|積極將上述意見和主張向蘇聯(lián)軍事顧問團代理團長季山嘉和中共兩廣區(qū)委書記陳延年提出建議。但是，季山嘉堅決反對。陳延年猶豫不決，說“不敢作主”，要“請示上海中央”才能決定。最后，毛澤東的正確主張沒有被以陳獨秀為首的黨中央所接受，相反采取了退讓妥協(xié)的政策，從而使蔣介石首先順利地控制了國民革命軍第一軍和黃埔軍校的領(lǐng)導(dǎo)權(quán)?！爸猩脚炇录焙?，從黃埔軍校和第一軍退出的共產(chǎn)黨員達250多人，毛澤東和周恩來建議把這批共產(chǎn)黨員派到其他軍中去，建立葉挺獨立團式的革命軍隊，但陳獨秀又拒絕了這一正確主張，因此這個計劃未能完全實行。

1926年5月，蔣介石又在國民黨二屆二中全會上，提出所謂《整理黨務(wù)案》，規(guī)定共產(chǎn)黨在國民黨中央及省、市黨部任執(zhí)行委員的人數(shù)不得超過全體委員會的三分之一，共產(chǎn)黨員不得擔(dān)任國民黨中央的部長等等。這是蔣介石企圖限制和削弱中國共產(chǎn)黨在統(tǒng)一戰(zhàn)線中的領(lǐng)導(dǎo)地位，陰謀篡奪國民黨黨權(quán)的又一個嚴(yán)重反革命步驟。中共中央派張國燾、彭述之去指導(dǎo)出席這次會議的中共黨團，在黨團會議上討論《整理黨務(wù)案》時，大家意見很不一致。最后，張國燾按照他同陳獨秀商定的讓步方針，要大家簽字接受。毛澤東拒絕簽字，主張“堅決頂住”，同時，在國民黨二屆二中全會表決《整理黨務(wù)案》時，他也沒有舉手。但是，由于陳獨秀等的退讓方針，《整理黨務(wù)案》還是被通過。擔(dān)任國民黨中央部長的共產(chǎn)黨員被迫全部辭職。毛澤東也離開了國民黨中央宣傳部。

隨著北伐戰(zhàn)爭的勝利進行，蔣介石欲篡奪黨、政、軍大權(quán)，建立獨裁統(tǒng)治的面目更加暴露無遺。1927年1月，中共和國民黨右派在武漢地區(qū)開展了以反對蔣介石軍事獨裁為中心內(nèi)容的“提高黨權(quán)運動”，而黨權(quán)運動的最高峰是3月中旬在武漢召開的國民黨二屆三中全會。毛澤東出席了這次會議，主張堅決反對以蔣介石為首的右派勢力。鑒于蔣介石和國民黨中央執(zhí)行委員會主席張靜江曾于1月3日在南昌召集中央政治會議臨時會議，擅自決議中央黨部和國民政府暫住南昌，挑起“遷都之爭”的事實，為防止當(dāng)時仍留在南昌的蔣介石、張靜江故伎重演，毛澤東在7日的預(yù)備會上提議：“在大會期間，政治會議停止開會，如有重大事故發(fā)生，應(yīng)付與主席團全權(quán)辦理”。這一提議得到于樹德的贊同。表決時，多數(shù)通過。毛澤東在會上還主張取消蔣介石操縱的黃埔同學(xué)會，亦獲全體通過。在共產(chǎn)黨人和國民黨左派的共同努力下，全會通過了多項限制蔣介石權(quán)力的決議。

蔣介石制造“贛州慘案”之后，3月15日，毛澤東主持的中央農(nóng)民運動講習(xí)所舉行陽新、贛州死難烈士追悼會。毛澤東在會上發(fā)表演說，指出：“在這革命的范圍內(nèi)，竟不斷演出慘殺農(nóng)工的事實，由此可證明封建的殘余勢力，正準(zhǔn)備著秣馬厲兵，向我們作最后的掙扎啊!從今日起，我們要下一決心，向那些反動分子勢力進攻，務(wù)期達到真正目的?！痹诠伯a(chǎn)黨人和國民黨左派的領(lǐng)導(dǎo)下，武漢地區(qū)掀起一個規(guī)模巨大的反蔣運動，這是武漢政府時期反對國民黨右派的高峰。