就在紅軍部隊為躲避國民黨步步緊逼的進攻而開始長征的同時，日本軍隊也進一步加強了對東北的控制。截至1935年，日本人開始向華北地區(qū)進軍。面對日本侵華力度的加大，國民黨黨內的一些將軍試圖勸說蔣介石抗日。然而，蔣介石固執(zhí)己見，認為打擊共產黨比保衛(wèi)國家不受日本侵略更為重要。這一分歧最后導致了1936年12月著名的“西安事變”，張學良將軍發(fā)動了反對蔣介石的行動。張學良原本也是東北軍閥，后來他在東北的地位被日本人取代，國民黨政府安排他到新的作戰(zhàn)基地西安負責圍剿共產黨。張學良對他所得到的新的任命非常不悅，他堅信日本才是當時中國最大的威脅。于是他策劃、組織了對蔣介石的綁架，將蔣介石作為人質扣押了兩個星期，直到蔣答應與共產黨協(xié)商合作。共同抗日才將其釋放。

與此同時，除了集中精力處理黨內事務，和在長征中奮力求得生存并在延安開展黨建工作外，毛澤東也一直密切注視著日本人的動向。他抓住一切機會寫作并發(fā)表分析評論文章，譴責蔣介石背信棄義的行為。1935年到1936年間，毛澤東發(fā)表了一系列連續(xù)將“日本帝國主義”和“蔣介石的背叛”聯(lián)系起來的文章和演講。毛澤東認為，蔣介石是日本帝國主義“侵掠”中國的“清道夫”，“在中國的反動支柱”。通過將日本如此輕易叩開中國大門的責任推到蔣介石身上，毛澤東得以將他自己和他領導下的中國共產黨置于抵抗日本的最前線。在發(fā)給張學良將軍的電報中，毛澤東宣稱，張學良扣押蔣介石不僅僅將國民黨逼上了抗日的道路，而且還“驅逐了軍隊中的法西斯分子，向廣大官兵昭示了蔣介石出賣國家、傷害人民的罪行” 。

毛澤東清晰地表達了希望蔣介石永遠讓出職權的愿望。但事態(tài)并未如此發(fā)展。與此相反，共產黨不得不與蔣介石協(xié)商，以開展新一輪的兩黨合作。協(xié)商耗時八個月，最終實現了國共兩黨間的第二次合作。與第一次國共合作不同，這一次的合作保證了兩黨各自的獨立性。周恩來作為組長帶領共產黨談判小組赴國民黨首都南京。毛澤東在寫給周恩來的信中說道：“首要原則就是保證我們”對紅軍部隊的“絕對領導權”；“原則是保證我黨的獨立性。在這些方面，我們絕不能妥協(xié)讓步。”

1937年7月，日本軍隊以北平盧溝橋事變?yōu)榻杩?，發(fā)起全面侵華戰(zhàn)爭。由于國民黨軍隊的混亂無序，日本軍隊以風馳電掣般的速度從北平向中國南部地區(qū)行進。1937年11月，另一股日軍攻占上海，那里的國民黨軍隊雖然進行了英勇的抵抗，但這種防衛(wèi)最終還是徒勞無功。日本軍隊長驅直入，直攻國民黨政府首都南京，在那里他們犯下了滔天罪行，發(fā)起了侵華戰(zhàn)爭期間最臭名昭著的“南京大屠殺”。蔣介石命令國民黨部隊撤離南京，逃到內陸地區(qū)。于是，日本軍隊就進入了一座沒有任何防守的城市。他們四處殺人放火，奸淫擄掠，暴力放蕩的日本人將殺人當成消遣，殘忍殺害數十萬手無寸鐵的中國人。這種慘無人道的行徑，在隨后日本占領中國長達八年的時間里，樹立了殘忍折磨中國人的行為模式。到20世紀30年代末，這種行為模式被簡化為日本軍隊的官方教條“三光”政策：燒光、搶光、殺光。

鑒于形勢的惡化，第二次統(tǒng)一戰(zhàn)線的部署非常急促。毛澤東停止了對蔣介石的書面攻擊，蔣介石也結束了國民黨部隊對延安的封鎖。國共兩黨間的合作在1937年秋終于達成。這次國共合作維系了幾年的時間，其間幾經波折和反復磨合。毛澤東一直保持著對統(tǒng)一戰(zhàn)線名義上的忠誠，即便是在20世紀40年代早期統(tǒng)一戰(zhàn)線破裂之時。