上海工人第三次武裝起義在1927年的3月21日發(fā)動了，整個行動，由特委會議指揮，緊急時由羅亦農(nóng)、周恩來、何松林（汪壽華）、陳獨(dú)秀指揮。周恩來分工在南市指揮，后來又到閘北前線。他身穿灰布棉袍，頭戴鴨舌帽，在總指揮部對著地圖同趙世炎邊商量邊決定，聽取報(bào)告，指示行動。經(jīng)過28小時戰(zhàn)斗，攻下北洋軍閥在上海的最后一個據(jù)點(diǎn)——北火車站。起義取得了勝利，完全是靠有組織的產(chǎn)業(yè)工人武裝作戰(zhàn)，打敗了幾千反動軍警。這是中國工人階級依靠自己的力量武裝起義勝利的光輝一頁。

工人起義勝利了，蔣介石等率北伐軍進(jìn)入了上海市，卻準(zhǔn)備著對起義的工人階級下毒手。4月11日夜到12日凌晨，他們用陰謀詭計(jì)繳了工人糾察隊(duì)的械，13日，開始了瘋狂的屠殺和搜捕。昔日的盟友徹底地露出了反動面目，是一個狠毒兇殘的劊子手。大批共產(chǎn)黨員和工人群眾倒在血泊中，中國共產(chǎn)黨的組織被迫轉(zhuǎn)入地下。周恩來起草了電報(bào)，與趙世炎、羅亦農(nóng)、陳延年、李立三、尹寬聯(lián)名致中共中央，主張迅速出師討伐蔣介石。電報(bào)中分析了軍事力量對比，認(rèn)為蔣介石處于不利地位。“為全局計(jì)，政治不宜再緩和妥協(xié)”。但這一建議沒有被蘇聯(lián)顧問鮑羅廷和陳獨(dú)秀所采納。

1927年5月下旬，周恩來由上海秘密到達(dá)中共中央所在地武漢。此前，在漢口召開的中共第五次全國代表大會上，周恩來被選為中央委員；在五屆一中全會上，又被選為中央政治局委員。25日，中央政治局常委會議決定周恩來任中共中央軍事部部長，必要時參加常委會議。29日，中央政治局常委會議決定周恩來代理中央常委職務(wù)，參加中央核心領(lǐng)導(dǎo)。從此以后，在長達(dá)半個世紀(jì)的時間內(nèi)，周恩來一直是中共中央的主要領(lǐng)導(dǎo)人之一。

周恩來領(lǐng)導(dǎo)軍事部后，以聶榮臻、王一飛、顏昌頤、歐陽欽等為助手，進(jìn)行了對軍隊(duì)的組織、聯(lián)絡(luò)，加強(qiáng)了軍隊(duì)的政治工作，向國民革命軍中派去朱德、陳毅、劉伯承等不少干部，并負(fù)責(zé)指導(dǎo)武漢的工人糾察隊(duì)和湖南、廣東的農(nóng)民運(yùn)動。這時，國民革命軍獨(dú)立第十四師師長夏斗寅在宜昌發(fā)動的武裝叛變雖已擊退，長沙許克祥又發(fā)動了反革命的“馬日事變”，武漢汪精衛(wèi)叛變革命的跡象越來越明顯，周恩來主張?jiān)谵r(nóng)民運(yùn)動力量強(qiáng)大的湖南農(nóng)村發(fā)動武裝起義。6月17日，他在中共中央常委會上提出，現(xiàn)在湖南18縣有8？000支槍，可以派人去集中起來，攻取反動力量弱的城池，如湘潭、瀏陽、平江等地。他建議省委下設(shè)軍委，各區(qū)設(shè)農(nóng)軍委員會，在可能范圍內(nèi)成立鄉(xiāng)村的臨時委員會，對許多反動軍隊(duì)強(qiáng)則擾之，弱則繳其械。會議同意了這一布置。20日，周恩來在中共中央常委會上又說，湖南省委決定派50人回去，把湖南劃為10個區(qū)，派10名懂軍事的干部去，做好準(zhǔn)備，根據(jù)政治局決定進(jìn)行暴動。但這些意見遭到共產(chǎn)國際代表的反對，沒有實(shí)現(xiàn)。陳獨(dú)秀在7月5日的中央常委會上甚至說，軍事工作應(yīng)該收縮。

7月15日，汪精衛(wèi)背叛孫中山的國共合作政策。他同蔣介石一樣，對共產(chǎn)黨員和革命群眾進(jìn)行了大屠殺。

中國共產(chǎn)黨已經(jīng)再無退路了，血的教訓(xùn)擦亮了共產(chǎn)黨人的眼睛，于是決定舉行南昌起義，以革命的暴力來反抗反革命的暴力。