分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第四版 精裝版）

目錄
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第1章 DNA的分離及定量 1
導(dǎo)言 2
方案1 SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA：少量制備 9
方案2 SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA：大量制備 12
方案3 從革蘭氏陰性菌（如E.coli）中分離DNA 15
方案4 乙醇法沉淀DNA 17
方案5 異丙醇法沉淀DNA 21
方案6 用微量濃縮機(jī)進(jìn)行核酸的濃縮和脫鹽 22
方案7 丁醇抽提法濃縮核酸 23
方案8 聚乙二醇沉淀法制備M13 噬菌體單鏈DNA 24
方案9 M13噬菌體鋪平板 27
方案10 M13噬菌體液體培養(yǎng) 30
方案11 M13噬菌體雙鏈（復(fù)制型）DNA的制備 32
方案12 利用有機(jī)溶劑分離純化高分子質(zhì)量DNA 35
方案13 用蛋白酶K 和苯酚從哺乳動物細(xì)胞中分離高分子質(zhì)量DNA 37
方案14 一步法同時提取細(xì)胞或組織中的DNA、RNA和蛋白質(zhì) 43
方案15 從鼠尾或其他小樣本中制備基因組DNA 46
替代方案：不使用有機(jī)溶劑從鼠尾分離DNA 48
替代方案：一管法從鼠尾中分離DNA 49
方案16 快速分離酵母DNA 50
方案17 微型凝膠電泳后使用溴化乙錠（EB）估算條帶中DNA數(shù)量 52
方案18 利用Hoechst 33258通過熒光分析儀估算DNA濃度 53
方案19 用PicoGreen定量溶液中的DNA 55
信息欄 56
第2章 DNA分析 62
導(dǎo)言 63
方案1 瓊脂糖凝膠電泳 73
方案2 瓊脂糖凝膠中DNA的染色檢測 76
方案3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 80
方案4 聚丙烯酰胺凝膠中DNA的染色檢測 85
方案5 聚丙烯酰胺凝膠中DNA的放射自顯影檢測 86
方案6 堿性瓊脂糖凝膠電泳 87
附加方案：堿性瓊脂糖凝膠的放射自顯影 90
方案7 成像：放射自顯影和感光成像 91
方案8 用玻璃珠從瓊脂糖凝膠中回收DNA 96
方案9 低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中DNA的回收：有機(jī)溶劑抽提法 98
方案10 聚丙烯酰胺凝膠中DNA片段的回收：壓碎與浸泡法 101
方案11 Southern印跡 103
方案12 Southern印跡：DNA從一塊瓊脂糖凝膠同時向兩張膜轉(zhuǎn)移 110
方案13 采用放射性標(biāo)記探針對固定在膜上的核酸DNA進(jìn)行Southern雜交 112
附加方案：從膜上洗脫探針 117
信息欄 119
第3章 質(zhì)粒載體克隆與轉(zhuǎn)化 122
導(dǎo)言 123
方案1 制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌的Hanahan 方法：高效轉(zhuǎn)化策略 126
方案2 制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌的Inoue 方法：“超級感受態(tài)”細(xì)胞 131
方案3 大腸桿菌的簡單轉(zhuǎn)化：納米顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 135
替代方案：一步法制備感受態(tài)大腸桿菌：在同一溶液中轉(zhuǎn)化和儲存細(xì)菌細(xì)胞 136
方案4 電穿孔法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 138
方案5 質(zhì)粒載體克?。憾ㄏ蚩寺?143
方案6 質(zhì)粒載體克?。浩侥┒丝寺?145
方案7 質(zhì)粒DNA的去磷酸化 148
方案8 向平末端DNA添加磷酸化銜接子/接頭 150
方案9 克隆PCR產(chǎn)物：向擴(kuò)增DNA的末端添加限制性酶切位點(diǎn) 151
方案10 克隆PCR產(chǎn)物：平末端克隆 154
方案11 克隆PCR產(chǎn)物：制備T載體 157
方案12 克隆PCR產(chǎn)物：TA克隆 159
方案13 克隆PCR產(chǎn)物：TOPOTA克隆 161
方案14 使用X-Gal和IPTG篩選細(xì)菌菌落：α-互補(bǔ) 165
信息欄 167
第4章 Gateway重組克隆 205
導(dǎo)言 206
方案1 擴(kuò)增Gateway載體 210
方案2 制備可讀框入門克隆和目的克隆 213
方案3 應(yīng)用多位點(diǎn)LR克隆反應(yīng)制備目的克隆 219
信息欄 222
第5章 細(xì)菌人工染色體及其他高容量載體的應(yīng)用 223
導(dǎo)言 224
方案1 BAC DNA的小量分離和PCR檢驗(yàn) 235
方案2 BAC DNA的大量制備和線性化 238
方案3 通過脈沖電場凝膠電泳檢驗(yàn)BAC DNA的質(zhì)量和數(shù)量 241
方案4 兩步BAC工程：穿梭載體DNA的制備 242
方案5 A同源臂（A-Box）和B同源臂（B-Box）的制備 244
方案6 克隆A和B同源臂到穿梭載體 247
方案7 重組穿梭載體的制備和檢驗(yàn) 249
方案8 通過電穿孔法轉(zhuǎn)化重組穿梭載體到感受態(tài)BAC宿主細(xì)胞 251
方案9 共合體的檢驗(yàn)和重組BAC克隆的篩選 253
方案10 一步BAC修飾：質(zhì)粒制備 256
方案11 A同源臂（A-Box）的制備 259
方案12 克隆A同源臂到報(bào)道穿梭載體 260
方案13 用RecA載體轉(zhuǎn)化BAC宿主 263
方案14 轉(zhuǎn)移報(bào)道載體到BAC/RecA細(xì)胞以及共合體的篩選 265
方案15 釀酒酵母（S.cerevisiae）的生長和DNA制備 267
方案16 酵母DNA的小量制備 269
信息欄 270
第6章 真核細(xì)胞RNA的提取、純化和分析 275
導(dǎo)言 276
方案1 從哺乳動物的細(xì)胞和組織中提取總RNA 279
替代方案 從小量樣本提取RNA 281
方案2 從斑馬魚胚胎和成體中提取總RNA 282
方案3 從黑腹果蠅提取總RNA 283
方案4 從秀麗隱桿線蟲中提取總RNA 285
方案5 從釀酒酵母菌中采用熱酸酚提取總RNA 287
方案6 RNA定量和儲存 289
方案7 RNA的乙醇沉淀 295
方案8 通過無RNase的DNaseⅠ處理去除RNA樣品中的DNA污染 297
方案9 Oligo（dT）磁珠法提取poly（A）+ mRNA 298
方案10 按照大小分離RNA：含甲醛的瓊脂糖凝膠電泳 308
方案11 根據(jù)分子質(zhì)量大小分離RNA：RNA的尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 312
方案12 瓊脂糖凝膠中變性RNA的轉(zhuǎn)膜和固定 319
替代方案 下行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移 323
方案13 聚丙烯酰胺凝膠的電轉(zhuǎn)移和膜固定 325
方案14 Northern雜交 327
方案15 純化RNA的點(diǎn)雜交和狹縫雜交 330
方案16 用核酸酶S1 對RNA作圖 342
方案17 核糖核酸酶保護(hù)分析：用核糖核酸酶和放射性標(biāo)記的RNA探針對RNA作圖 349
方案18 引物延伸法分析RNA355
信息欄 359
第7章 聚合酶鏈反應(yīng) 363
導(dǎo)言 364
方案1 基礎(chǔ)PCR 375
方案2 熱啟動PCR 380
方案3 降落PCR 383
方案4 高GC含量模板的PCR擴(kuò)增 385
方案5 長片段高保真PCR（LA PCR） 390
方案6 反向PCR 393
方案7 巢式PCR 397
方案8 mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA的擴(kuò)增：兩步法RT-PCR 400
方案9 由mRNA的5′端進(jìn)行序列的快速擴(kuò)增：5′-RACE 409
方案10 由mRNA的3′端進(jìn)行序列的快速擴(kuò)增：3′-RACE 416
方案11 使用PCR 篩選克隆 422
信息欄 424
第8章 生物信息學(xué) 431
導(dǎo)言 432
方案1 使用UCSC基因組瀏覽器將基因組注釋可視化 434
方案2 使用BLAST和ClustalW進(jìn)行序列比對和同源性檢索 444
方案3 使用Primer3Plus設(shè)計(jì)PCR引物 450
方案4 使用微陣列和RNA-seq進(jìn)行表達(dá)序列譜分析 461
方案5 將上億短讀段定位至參考基因組上 472
方案6 識別ChIP-seq數(shù)據(jù)集中富集的區(qū)域（尋峰） 483
方案7 發(fā)現(xiàn)順式調(diào)控基序 495
信息欄 503
第9章 實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測DNA及RNA 509
導(dǎo)言 510
方案1 實(shí)時PCR反應(yīng)用引物和探針濃度的優(yōu)化 532
方案2 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 537
方案3 實(shí)時熒光PCR定量檢測DNA 540
方案4 實(shí)時熒光PCR定量檢測RNA 542
方案5 實(shí)時熒光PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和歸一化 545
信息欄 550
第10章 核酸平臺技術(shù) 551
導(dǎo)言 552
方案1 印制微陣列 560
方案2 Round A/Round B DNA擴(kuò)增 564
方案3 核小體DNA和其他小于500bp的DNA的T7線性擴(kuò)增（TLAD） 567
方案4 RNA的擴(kuò)增 572
方案5 RNA的Cyanine-dUTP直接標(biāo)記 578
方案6 RNA的氨基烯丙基-dUTP 間接標(biāo)記 581
方案7 用Klenow酶對DNA進(jìn)行Cyanine-dCTP標(biāo)記 583
方案8 DNA的間接標(biāo)記 585
方案9 封閉自制微陣列上的多聚賴氨酸 587
方案10 自制微陣列的雜交 589
第11章 DNA測序 595
導(dǎo)言 596
方案1 毛細(xì)管測序質(zhì)粒亞克隆的制備 620
方案2 毛細(xì)管測序之PCR產(chǎn)物的制備 625
方案3 循環(huán)測序反應(yīng) 627
方案4 全基因組：手工文庫制備 630
方案5 全基因組：自動化的無索引文庫制備 636
附加方案 自動化的文庫制備 642
方案6 全基因組：自動化的帶索引文庫制備 644
方案7 用于Illumina測序的3kb末端配對文庫的制備 651
方案8 用于Illumina測序的8kb末端配對文庫的制備 659
附加方案 AMPure 磁珠校準(zhǔn) 671
方案9 RNA-Seq:RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA及其擴(kuò)增 673
附加方案 RNAClean XP磁珠純化（RNA-Seq前） 679
方案10 液相外顯子組捕獲 680
附加方案 AMPure XP磁珠純化 688
附加方案 瓊脂糖凝膠大小篩選 689
方案11 自動化大小篩選 690
方案12 用SYBR Green-qPCR進(jìn)行文庫定量 693
方案13 用PicoGreen熒光法進(jìn)行文庫DNA定量 696
方案14 文庫定量：用Qubit系統(tǒng)對雙鏈或單鏈DNA進(jìn)行熒光定量 700
方案15 為454 測序制備小片段文庫 702
方案16 單鏈DNA文庫的捕獲及emPCR 708
方案17 Roche/454 測序：執(zhí)行一個測序運(yùn)行 714
方案18 結(jié)果有效性確認(rèn) 721
方案19 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估 723
方案20 數(shù)據(jù)分析 724
信息欄 725
下冊
第12章 哺乳動物細(xì)胞中DNA甲基化分析 729
導(dǎo)言 730
方案1 DNA亞硫酸氫鹽測序法檢測單個核苷酸的甲基化 735
方案2 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法檢測特定基因的DNA甲基化 742
方案3 基于甲基化胞嘧啶免疫沉淀技術(shù)的DNA甲基化分析 745
方案4 高通量深度測序法繪制哺乳動物細(xì)胞DNA甲基化圖譜 749
方案5 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA文庫的Roche 454克隆測序 760
方案6 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA文庫的Illumina測序 765
信息欄 770
第13章 標(biāo)記的DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針的制備 775